生物樣品分析一般指的是生物基質樣品中的目標化合物的定量分析，臨床檢測、藥物研究中的BE、PK/PD都涉及到生物樣品分析。生物樣品基質一般是血漿、血清、尿液、膽汁、糞便和組織臟器等。分析方法最主要的是要保證分析的準確度、精密度和重現性，生物樣品分析相較于化學分析比較難的是生物樣品基質存在很大的基質干擾，同時很多藥物在體內的穩定性和體外有很大的不同。建立生物樣品分析方法首先從體外分析開始，再加入基質去建立方法。
一．不含基質樣品分析方法：
1.1質譜參數優化：
生物樣品分析的藥物濃度低、基質干擾大，為了達到比較高的靈敏度，一般都是用LC/MS-MS來分析。建立分析方法第一步是拿到COA之后考慮目標物的溶液的穩定性，找到合適的溶劑，兼顧穩定性和液質分析的適用性。接著建立目標物的質譜方法，Q1掃描目標物的分子離子峰，MS2掃描分子離子峰的子離子，選擇高響應的離子對進行MRM參數優化，保存最優化的參數，最后修改為和液相色譜串聯的方法，修改霧化氣流量和離子源溫度。
1.2液相參數：
配置適合濃度的樣品進行LC-MS/MS分析，優化初步的液相方法，液質聯用一般都是選用100mm的短柱，經驗上乙腈做流動相峰形比較好，甲醇做流動相質譜響應會提高，有些情況加入一定量的甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨等也會提高響應，同時也有助于改善峰形。確定了初步的液質分析方法后，下一步要優化含有生物基質樣品分析方法。
二．基質樣品分析：
2.1樣品前處理：
生物樣品基質效應大，樣品前處理時生物樣品分析很重要的一步，根據第一步中化合物的響應，將藥物添加到生物基質中，配制適合濃度的基質樣品，這里需要注意有機試劑的含量不要超過總體積的5%，生物樣品前處理方法一般包括蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等，蛋白沉淀處理簡單，但基質效應大，根據藥物的性質選擇合適的前處理方法。對樣品進行前處理后，利用一進行LC-MS/MS分析，如果根據色譜圖就能明顯看到干擾峰，那需要進一步優化色譜條件，包括流動相和色譜柱都可能需要更換。
除了色譜峰的干擾，采用MRM掃描相對來說選擇性已經很高了，但基質成分會抑制或增強藥物的信號濃度，有的甚至會導致待測物一點信號都沒有，在這種情況下，優化色譜條件幾乎沒有什么改善了，只能從前處理方法來下文章了，如何降低基質效應，可以參考公眾號之前推送的生物樣品分析方法中基質效應的考察和如何降低生物樣品分析基質效應。
回收率基本也是前處理所影響的，蛋白沉淀不需要過多考慮回收率的問題，液液萃取和固相萃取需要多加關注，基質效應和回收率都是不要求達到100%，但是基質效率大的話，對高濃度和低濃度樣品基質干擾的程度一般是不一樣的，這樣很容易導致分析批的分析結果失敗，ISR也容易失敗。回收率不高的話也需要多做考察是哪些因素導致了回收率低，在處理樣品的時候注意避免操作的不一致影響分析結果。這樣才能保證分析的準確度和精密度。
2.2實際樣品的考察
藥物加入到基質中后，處理液在質譜沒有信號還有種可能是藥物加入基質中就被代謝了，體外試驗的基質中酶相對比較少了，需要通過一段時間來確定，可以參考第三部分3.3的室溫放置穩定性。
還有種情況是藥物一進入到體內就被代謝，這樣的話前面的工作就需要從新調整，監測代謝產物可能是比較好的方案了，確定這種情況就需要檢測實際樣品來驗證之前的檢測方案，這是生物樣品分析中很常見的，仿制藥BE試驗的樣品有很多的資料可以參考，但新藥或者新化學物質參考資料很少，找代謝產物以及代謝產物的結構確證有時候也會是個不小的工作量。
三．穩定性
3.1溶液中的穩定性
確定了初步的分析方法后，還需要考察穩定性，藥物在溶液中的穩定性應該是在一開始就需要考察的，需要考察在儲存條件下母液的穩定性，保證母液的藥物濃度在分析過程中是準確的。
3.2基質樣品前處理后藥物的穩定性：
基質樣品經過前處理后，需要考察剛處理的樣品和處理后放置一段時間后藥物含量是否有變化，處理后的穩定性要能保證樣品處理到檢測完成這個過程中，待測物是穩定的，如果穩定性達不到要求，需要從新優化條件。
3.3 基質樣品室溫放置的穩定性：
將剛配制的樣品和室溫放置一段時間的相同濃度的樣品進行分析，考察樣品在室溫放置是否穩定，保證樣品取出到處理結束這個過程中樣品是穩定的，如果不穩定，那需要找到影響穩定性的因素，規避掉這些因素，在穩定的條件下去處理樣品，如基質內可能會存在一些酶，有些藥物會立即被酶代謝，這個時候可以考慮取樣后立即將酶滅活。實在無法達到就需要將時間縮短，保證在這個時間范圍內樣品是穩定的。
3.4凍融穩定性：
凍融穩定性是考察樣品經過一次或多次凍融后的穩定性，一般做1,2,3,4次凍融，先分析4次凍融樣品是否穩定，不穩定再分析3次凍融，依次往下。
穩定性考察是為了保證在樣品接收到檢測過程中樣品是穩定的，方法建立過程中需要考察影響樣品穩定的因素，在分析過程中進行規避。
以上是生物樣品分析方法建立時必須要考慮的問題，方法建立往往不是一蹴而就的事情，有很多細節需要琢磨。呈現在紙面的更多是方法確證和樣品檢測結果，但花多一點時間去做方法絕對是磨刀不誤砍材工的，由于作者經驗和水平有限，如有錯漏，歡迎大家拍磚。
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