生物樣品分析方法確證（一）

前幾期討論了藥品質量標準建立過程中的分析方法的確證，廣受好評，今天小編來總結下藥品臨床前和臨床研究中生物樣品分析的分析方法的確證，生物樣品分析一般指測定生物基質（血漿、血清、全血、尿、糞便、膽汁、組織等）中的藥物濃度，和藥品質量標準中的分析最大的不同是基質復雜，小分子化藥一般采用LC-MS/MS方法檢測。生物樣品分析方法確證一般應包括：選擇性、準確度、精密度、殘留、線性范圍、基質效應、回收率、最低定量限、稀釋線性、穩定性（溶液中的穩定性、基質中的穩定性、樣品處理后的穩定性、凍融穩定性）。由于生物樣品分析方法要求的細則比較多，這部分將分成兩篇介紹。

為了驗證分析方法，除配制標準曲線外，還需要以待分析樣品相同的空白基質配制質控樣品，如果不能獲得或難以獲得與待分析樣品相同的基質，采用其他基質代替時應說明原因。一般需配制成低、中、高三個濃度的質控樣品（QC），低濃度（LQC）不高于3倍定量下限，中濃度（MQC）接近標準曲線中部，高濃度質控（HQC）約為定量上限的75%。

1. 選擇性（Selectivity）：使用至少6名受試者的空白基質來考察（動物基質可以用不同批次的空白基質），空白基質中的干擾組分的響應低于分析物定量下限（LLOQ）的20%（如果有多個分析物，每個分析物都需要考察），內標的干擾組分的響應應低于內標響應的5%。這里需要注意的是藥典的指導原則中動物基質可以使用不同批次的混合基質FDA的指導原則中只說了需使用6批不同來源的空白基質，建議使用不混合基質考察。

2. 準確度（Accuracy）：是描述測得值和真實值的接近程度，用相對偏差[(測得值-真實值)/真實值)]×100%表示，準確度又分為批內和批間準確度，批內準確度每個濃度至少需要5個樣品，質控樣品的測定的偏差應在±15%以內，LLOQ的測定的偏差應在±20%以內。批間準確度至少3個分析批，且至少應在2天進行，每個分析批每個濃度至少5個樣品，質控樣品的批間測定的偏差應在±15%以內，LLOQ的批間測定的偏差應在±20%以內。

3. 精密度（Precision）：是描述分析方法重復分析的接近程度，通過多次測量值的相對標準差（變異系數）來計算，也分為批內和批間精密度，也是通過測定定量下限和低、中、高質控樣品來考察，批內精密度每個濃度至少需要5個樣品，批內的變異系數質控樣品應±15%以內，LLOQ的批內變異系數應在±20%以內，批間精密度至少需考察3個分析批，且至少應在2天進行，批間的變異系數質控樣品應±15%以內，LLOQ的批間變異系數應在±20%以內

4. 最低定量限和標準曲線（Lower Limit of Quantification and Calibration/Standard Curve）：最低定量限是指能被可靠定量樣品中分析物的最低濃度，標準曲線應盡量覆蓋預期的濃度范圍，至少應該包含6個校正濃度水平，同時還應該有零濃度樣品（zero sample，含內標的空白基質處理樣品）、空白樣品（blank sample，不含分析物和內標的空白基質處理樣品），至少考察3條標準曲線，校正標樣的回算濃度的準確度和精密度不超過15%，定量下限在20%以內，75%的校正標樣至少6個有效濃度（定量下限必須符合）符合這一標準，FDA指導原則還要求定量上限（ULOQ）的準確度和精密度都不超過15%。如果配制8個濃度標準樣品，至少需要有6個點通過，其中最低點必須通過，如果同一濃度水平有多個樣品或標準曲線點超過8個，那么需要樣品總數的75%的點都通過，且必須至少包含6個濃度水平，同樣最低點必須通過。

   
   

質控樣品必須有67%（三分之二）的準確度在15%以內，同一濃度必須至少有50%的樣品準確度在15%以內。

5.殘留：殘留的考察可以通過進樣高濃度樣品（建議為標準曲線最高點）后進空白樣品，空白樣品可以為流動相，待測物殘留不超過LLOQ的20%,內標殘留不超過5%。可以每個分析批考察。

6.  稀釋可靠性：稀釋可靠性是考察分析方法分析高濃度樣品稀釋后測定的準確度，一般先配置高濃度質控樣品，用待測樣品相同的空白基質按一定比例稀釋，稀釋倍數根據待測樣品的濃度范圍決定。每個稀釋因子至少需5個測定值，準確度和精密度不超過15%。