不得不看的載體構建的心得與體會
這兩年在美帝凈做克隆實驗了，以前讀PHD時候還覺得自己分子克隆挺牛X的，來這邊之后做了各種各樣的構建才知道以前是坐井觀天，剛才粗粗統計了一下，在美帝一年零八個月，我構建的質粒的超過四百個，其中有很簡單從PCR構建到拿WB結果的一共不到一周，也有巨難的花了四個月時間換了幾次strategy才弄好激動得我半夜給老板發信的品種;有單片段酶切插入這種不用腦型的，也有九個片段逐一插入正反向還不同的。專家不敢說，但是熟能生巧，確實積累了不少經驗，現在系里從POSTDOC到PHD學生到TECH構建前很多人都跟我商量(做博后結果成了技術員的人生真悲哀啊)。我老板甚至開玩笑說，我們將來開個公司，我專門負責構建(這話聽得我想揍他大家同意不?)想了想還是把經驗寫下來，一來做個記錄，二來博同行一笑，能讓大家少繞點彎路則更好。1. 準備工作俗話說用欲善其事，必先利其器。我強烈建議大家在做構建之前先找好工具，這樣起的效果事半功倍。這里說個笑話，我們系有個新......閱讀全文
shRNA干擾載體構建
產品技術背景pRI系列載體是基于III類RNA聚合酶啟動子：人類H1啟動子的專用于哺乳動物細胞RNA干擾的載體。H1啟動子在哺乳動物細胞內合成類似siRNA分子的小分子RNA。由于H1啟動子有精確的轉錄起始位點和終止信號，H1啟動子轉錄產物精確生成人工設計的shRNA，shRNA經過RISC剪切后形
RNAi表達載體構建
近年來的研究表明，一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達，誘使細胞表現出特定基因缺失的表型， 稱為RNA干擾（RNA interference，RNAi）。siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子，能夠
RNAi表達載體構建
近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分子,能夠
shRNA干擾載體構建
產品技術背景pRI系列載體是基于III類RNA聚合酶啟動子：人類H1啟動子的專用于哺乳動物細胞RNA干擾的載體。H1啟動子在哺乳動物細胞內合成類似siRNA分子的小分子RNA。由于H1啟動子有精確的轉錄起始位點和終止信號，H1啟動子轉錄產物精確生成人工設計的shRNA，shRNA經過RISC剪切后形
siRNA表達載體的構建
? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U
siRNA表達載體的構建
實驗方法原理 多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RNA, shRNA)在哺乳動物細胞中的表達。這三類啟動子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6啟動子和人H1啟動子。之所以采用RNA pol
植物表達載體的構建
實驗概要本實驗介紹了一種構建植物表達載體的方法。實驗步驟1. 植物正義表達載體的構建??? 1) 用SmaI和SacI雙酶切pTriplEx2-GhMT3a和植物表達載體pBI121：??? 2) 進行瓊脂糖凝膠電泳，回收GhMT3a片段和pBI121載體；??? 3) 連接：連接體系為：混勻后4-
RNAi表達載體構建（一）
近年來的研究表明,一些短片斷的雙鏈RNA可以通過促使特定基因的mRNA降解來高效、特異的阻斷體內特定基因表達,誘使細胞表現出特定基因缺失的表型, 稱為RNA干擾（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是這種短片斷雙鏈RNA分
siRNA表達載體的構建
siRNA表達載體構建可應用于：（1）作為后基因組時代基因功能分析的有力工具；（2）基因組學、細胞信號傳導通路分析；（3）藥物靶點篩選、疾病治療。實驗方法原理多數的siRNA表達載體依賴三種RNA聚合酶III 啟動子(pol III)中的一種，操縱一段小的發夾RNA(short hairpin RN
RNAi表達載體構建（二）
（2）、序列同源性分析:?將潛在的序列和相應的基因組數據庫（人,或者小鼠,大鼠等等）進行比較,排除那些和其他編碼序列/EST同源的序列.例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）選出合適的目標序列進行合成.并非所有符合條件的siRNA都一樣有效,其原因還不清楚
sgRNA的設計與載體構建
實驗概要1. CRISPR的介紹：? ?? ? CRISPR的全稱為Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic ?Repeats(規律成簇的間隔短回文重復序列)。實際上就是一種基因編輯器，由于細菌自身具有降解入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免
原核表達載體的構建介紹
1、獲得目的基因 （1）通過PCR方法：以含目的基因的克隆質粒為模板，按基因序列設計一對引物（在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點），PCR循環獲得所需基因片段。 （2）通過RT-PCR方法：提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉錄形成cDNA第一鏈，以逆轉錄產物為模板進行PCR循環獲得產物
真核基因表達載體的構建
提高目的基因在哺乳動物細胞中表達的策略：1、DNA水平：增加基因拷貝數(1)高拷貝載體；（2）基因共擴增；2、轉錄水平：利用強啟動子、增強子，可誘導啟動子，如CMV、Tet；3、翻譯水平：優化翻譯起始序列和非編碼區序列。本篇文章來源于網絡，如有異議請聯系我們，我們將在3個工作日內作出處理。
自殺性質粒載體的構建
自殺性質粒載體完全可以自己構建，只要保證兩點：１，自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行復制，也就是說載體上不能有能在宿主菌中復制的復制子；２，要由篩選標記．?自殺性質粒載體不能在你的宿主菌里進行復制，否則會導致細菌染色體突變株的構建失敗。但是在構建時，要注意以下方面：1。在制備質粒載體和DNA插入片
無縫克隆：讓載體構建如此簡單
基因克隆或分子克隆，是應用酶學方法在體外將不同來源的DNA分子重新組裝成雜合分子，并使之在適當的宿主細胞中進行擴增，形成大量子代DNA分子的過程。基因克隆方法經過幾十年的發展，從傳統的DNA連接酶介導的平粘末端克隆及TA克隆技術，到基于拓撲異構酶的TOPO克隆技術，再到基于DNA重組酶的Gatewa
基因編輯鼠－sgRNA表達載體構建
繼上次發表的Guide RNA設計和篩選的相關知識之后，希望大家還沒有忘記相關的操作和技巧，今天，我們就來和大家聊聊后續的實驗，在基因編輯鼠的過程中，sgRNA表達載體是如何構建的呢？在靶點篩選結束之后，下一步就要進行sgRNA載體構建。在構建表達載體前，應根據實驗目的選取合適的表達質粒。比如進行實
篩選質粒載體構建表達文庫實驗
試劑、試劑盒 封閉緩沖液氯仿裂解緩沖液檢測抗原-抗體復合物所用試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩沖液 125I 標記的蛋白質 A 或 125I 標記的免疫球蛋白放射性碘化第二抗體第一抗體LB 或 SOB 瓊脂平板儀器、耗材 空氣培養箱平頭鑷子 裝有防水黑墨水（印度墨水）并帶有 18 號針頭的注射器硝酸纖維
構建λ噬菌體載體的基本途徑介紹
構建λ噬菌體載體的基本途徑如下： ①抹去某種限制性內切酶在λDNA分子上的一些識別序列,只在非必需區保留1～2個識別序列； ②用合適的限制性內切酶切去部分非必需區,但是由此構建的λDNA載體不應小于38kb； ③在λDNA分子的合適區域插入可供選擇的標記基因。值得指出的是,沒有適用于克隆所
篩選質粒載體構建表達文庫實驗
? ? ? ? ? ? 試劑、試劑盒 封閉緩沖液 氯仿 裂解緩沖液 檢測抗原-抗體復合物所用試劑 SM TNT 緩沖液 洗滌緩沖液
M13噬菌體載體的構建
在IS區內插入LacZ基因 ⑵在標記基因區內組裝MCS區段所以能通過a互補在X-Gal/ IPTG平板上識別重組體。這類載體包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等這類載體的突出優點在于其既可以提供單鏈DNA，也可以提供雙鏈的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表現不穩定，在
篩選質粒載體構建表達文庫實驗
檢測結合抗體的方法有以下 3 種：放射化學篩選，生色反應篩選及化學發光反應篩選。3 種方法的優缺點在本章導言中有所論述。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。試劑、試劑盒封閉緩沖液氯仿裂解緩沖液檢測抗原-抗體復合物所用試劑SMTNT 緩沖液洗滌緩
酵母表達載體的構建與酵母轉化
實驗概要本實驗介紹了酵母表達載體的構建、酵母轉化方法及酵母抗逆實驗。主要試劑試劑配制：1 .1 M Tris.Cl(pH 7.5)(100 ml)：12.1g Tris堿，加80 ml ddH2O，濃HCl調pH 7.5，定容至100 ml；2. 0.5 M EDTA(pH 8.0) (100 ml
RNA干擾載體的構建的實驗流程
RNA干擾載體主要用來研究基因表達調控，RNA干擾技術已已被廣泛用于基因結構功能研究和傳染性疾病及基因治療領域，進行RNA干擾實驗首先是構建RNA干擾載體，本文以pRI系列載體為例論述了干擾載體的構建的實驗流程。產品技術背景pRI系列載體是基于III類rna聚合酶啟動子：人類H1啟動子的專用于哺乳動
腺相關病毒載體的基本構建介紹
1、AAV病毒的感染細胞 AAV載體對于骨骼肌、視網膜、肝細胞、心臟平滑肌細胞、神經元細胞、胰島B細胞、關節滑膜細胞等具有良好的感染效果，而對于淋巴細胞、造血干細胞、神經膠質細胞、成纖維細胞等感染效果較差。 2、病毒的加樣量 病毒量為10-10V.P/Cell時最佳。如果太低，基本檢測不出
靶向－EGFR基因－siRNA表達載體的構建
實驗材料靶向EGFR基因siRNA試劑、試劑盒pSilencer2.1-U6載體EcoR IBamH IT4 DNA連接酶鼠抗人anti-EGFRFITC標記兔抗小鼠IgGCy3標記兔抗小鼠IgG甘油多聚甲醛二甲基亞砜儀器、耗材流式細胞儀熒光顯微鏡二氧化碳細胞培養箱酶標儀培養板蓋玻片載玻片利用Lip
載體構建實驗常見問題大解析
大家是否在實驗中經常遇到載體構建的各種問題，浪費大量的時間和精力，各種各樣的問題讓人頭疼，海創科業小編作為科研老司機特意為各位科研君整理了載體構建實驗常見問題及解決方法，希望能夠幫助到大家。1. ? ? ? PCR載體構建大部分時候都要通過PCR的方法獲取目的片段，擴增PCR的時候大家盡量選用高保真
LSCM熒光表達載體的選擇和構建
熒光表達載體的選擇和構建當對目的蛋白的功能或定位情況了解較少的情況下，可以嘗試把熒光蛋白位于目的蛋白的?N?末端或?C?末端。但當目的蛋白上已經存在定位信號或末端存在修飾，需要把熒光蛋白插入到目的蛋白理想的位置，這樣可以避免熒光蛋白的插入對蛋白功能或定位產生影響。由于綠色熒光蛋白存在缺陷，因此?GF
LSCM綠色熒光融合蛋白表達載體的構建
綠色熒光融合蛋白表達載體的構建?綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)?及其突變體能在各種不同的生物系統中表達，這對細胞生物學的研究具有重要意義。而熒光蛋白的折疊能力及其同細胞內蛋白的融合能力，使研究?者能直接在細胞體內觀察到蛋白質的特性。研究者不需要把蛋白質經過
構建復制缺陷型皰疹單純病毒載體實驗
基本方案1 構建 HSV-1 IE基因補足型細胞系 基本方案2 構建有復制缺陷的載體 基本方案3 將外源基因序列插入到復制缺陷性基因組人類單純皰疹病毒（HSV)載 體 ? ? ? ? ? ?
質粒克隆載體的設計和構建的原則
①選擇合適的出發質粒出發質粒也叫親本質粒，它應含有質粒克隆載體必備的元件，如復制起始位點、選擇標記基因、克隆位點、啟動子和終止子等。②正確獲得構建質粒克隆載體的元件一般采用限制性核酸內切酶切割出質粒DNA分子，獲得含有某種元件的DNA片段，還可以采用PCR技術從靶DNA中擴增出含某種元件的特異性DN