cDNA文庫組標準流程3
二.mRNA的分離 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 準備工作： 1.將Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋轉混勻，溶解 Oligotex.,然后置于室溫。 2.將OBB Buffer置于37℃水浴中，旋轉混勻，重溶沉淀物，然后置于室溫。 3.將 OEB Buffer 置于70℃水浴中，待用。試驗步驟： 表3：加入試劑量據此表Total RNARNase-free Water to:Buffer OBB(ul)Oligotex Suspension(ul)Prep size<=0.25mg250ul250ul15Mini0.25-0.5mg500ul500ul30Midi0.5-0.75mg500ul500ul45Midi0.75-1.00mg500ul500ul55Midi1.TotalRNA量不要多于1mg ，用移液器取出所需RNA量到1.5ml離心管中，加RNase......閱讀全文
cDNA文庫組標準流程3
二.mRNA的分離 1.Oligotex mRNA Kits (QIAGEN）法 準備工作： 1.將Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋轉混勻，溶解 Oligotex.,然后置于室溫。 2.將OBB Buffer置于37℃水浴中，旋轉混勻，重溶沉淀物，然后置于室溫。 3.將
cDNA文庫組標準流程5
4EcoRIadaptor加接:1.往雙鏈 cDNA沉淀中加入9ulEcoRI adaptor(400ng/ul),4℃至少放置30分鐘以充分溶解cDNA沉淀;2.溶解完成后,順序加入下列試劑:1.2ul 10×Ligase Buffer1ul 10mMrATP1ul T4DNA Ligase(4U
cDNA文庫組標準流程1
一.Total RNA的提取 (一) 試劑配制 準備工作： 1.研缽、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml /100ml容量瓶、藥匙、 試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內,180℃，烤6小時。 2.50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料
cDNA文庫組標準流程2
(二)動物組織totalRNA的提取 1．根據表1選擇適當的組織量和相應的變性裂解液量，將變性裂解液分裝到RNase-free的50ml無菌離心管中，冰浴5分鐘。 2．將組織樣品放入變性裂解液中，在高速下勻漿15-30秒/次，直到看不見組織和細胞碎片。 3．根據表1加入適量2M的乙酸鈉（pH4.0）
cDNA文庫組標準流程4
三．cDNA雙鏈合成1.SupersciptII —RT合成第一鏈:1.在一RNase-free的0.2mlPCR管中,加入xul mRNA(大約500ng)1ul XhoIPrimer(1.4ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAACTAGTCTCGAGTTTTTTTTTTTT
cDNA文庫組標準流程7
2．檢測：（PCR方法）取適量PCR薄壁管，置于冰上，按以下體系依次加入：各試劑均加好后，離心機上甩一下，使之沉底，置于PCR儀上待 PCR反應進入4℃后，取下PCR薄壁管，取7ulPCR產物加入3ul溴芬蘭跑電泳，同時上1Kb DNA ladder半小時后照相，觀察膠圖：insert、vector
cDNA文庫組標準流程6
2．pBlueScriptII的雙酶切消化 1．以如下體系進行EcoRI酶切： pBSK(+) X μl（6μg） ddH2O 174-X μl 10×Buffer E 20 μl 混勻，加入限制性內切酶： EcoRI （10U/ μl） 6 μl 總體積為200 μl。 2．輕彈管壁或用槍頭輕輕吹
cDNA文庫組標準流程六:電轉化流程
1．電轉化感受態細胞的制備1.????? 用槍頭挑取單克隆菌落，投入盛有10ml LB液體培養基的50ml離心管中。（同時做培養基和槍頭的空白對照）2.????? 37℃，220rpm，培養14-16個小時。3.????? 第二天，以1：100的比例將這10ml菌液倒入1000ml LB液體培養基中
cDNA文庫組標準流程三:cDNA雙鏈合成
1. Superscipt II—RT合成第一鏈:1. 在一RNase-free的0.2ml PCR管中,加入???????? xul?? mRNA(大約500ng)???????? 1ul?? Xho I Primer(1.4ug/ul)?????????? (5’ GAGAGAGAGAGAGAG
cDNA文庫組標準流程八:pBlueScript－cDNA庫擴增
1．試劑及配方：2 x LB （1升）：??????? 20g??? 氯化鈉??????? 20g??? 蛋白提取物??????? 10g??? 酵母提取物????? 加入蒸餾水至1升，用NaOH調pH值至7.0，高壓滅菌2 x LB－甘油（12.5%）（200ml）175ml? 2 x LB液體2
cDNA文庫組標準流程二:mRNA的分離
1.Oligotex mRNA Kits? (QIAGEN）法?準備工作：1.將Oligotex Suspension 置于37℃水浴中，旋轉混勻，溶解Oligotex.,然后置于室溫。2.將OBB Buffer置于37℃水浴中，旋轉混勻，重溶沉淀物，然后置于室溫。3.將OEB Buffer 置于7
cDNA文庫組標準流程四:載體制備
1．pBlueScriptII的提取1．取1ul商品的pBlueScriptII，轉化入大腸桿菌宿主菌中，取5ul轉化產物均勻涂布在含AMP的LB平板上，37℃培養過夜。2．第二天取一只無菌的50ml離心管，加入10ml AMP抗性的LB液體培養基，挑單克隆于離心管中，37℃，250rpm，培養過夜
cDNA文庫組標準流程七:快速鑒定、菌落PCR
1．質粒快速鑒定??試劑：Protoplasting buffer:30mM Tris-HCl, pH8.0 ??????????????????0.33ml/1.0M????? 5mM EDTA ??????????????????????????????0.1ml/0.5M????? 50mM
cDNA文庫組標準流程一:Total－RNA的提取
1.試劑配制準備工作：1、研缽、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、藥匙、 試劑瓶等玻璃制品均用錫紙包裹口部，置于烤箱內,180℃，烤6小時。2、50ml/1.5ml離心管、槍頭等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡過夜后，121℃ 20mins
cDNA文庫組標準流程五:cDNA雙鏈和載體的連接
1.連接：根據載體和cDNA的電泳定量結果，每個樣品設置3個比例的連接，即：insert/vector=1/3? incert/vector=1/1?? insert/vector=3/1按以下體系依次加入：????? ddH2O????????????????????? xulT4 ligase
cDNA－文庫的構建3
階段 5:SepharseCL-4B 凝膠過濾法分離 cDNA材料緩沖液和溶液乙醇乙酸鈉（3 ml/L,pH5.2)TE(pH7.6)含 0.1mol/LNaCl 的 TE(pH7.6)Tris-HCl(1mol/L,pH8.0)凝膠瓊脂糖凝膠（1%)見步驟 8。核酸和寡核苷酸cDNA階段 4 中步
cDNA文庫的構建3
接頭-銜接子與cDNA的連接8.將下列試劑加入到已削成平末端的DNA中：10×T4噬菌體DNA聚合酶修復緩沖液 2μl800~1000 ng 的磷酸化接頭或銜接子 2μlT4噬菌體DNA連接酶（105 Weiss單位/ml） 1μl10 mmol/L ATP 2μl混勻后，在16℃溫育8~12h。9
差減cDNA文庫法3
[大量制備生產單鏈噬菌體DNA]1.新鮮過夜培養的宿主菌XLI-Blue，以1：20稀釋在LB培養液中，在37℃培養擴增2小時。2.加1ml含單鏈cDNA的上清液。3.再于37℃繼續培養2小時。4.然后將全部溶液轉到500~1000mlLB中，生長5~6小時。5.9500rpm離心60分鐘，除去細菌
CDNA文庫
?CDNA文庫（主要內容如下）·?????????Construction of cDNA Library·?????????Construction of Genome DNA Library·?????????Library Screening??OthersConstruction of cD
基因組文庫和cDNA文庫的構建及篩選
劉芝華 中國醫學科學院腫瘤研究所??分子腫瘤學國家重點實驗室?概念：?基因組文庫是含有某種生物體全部基因的隨機片段的重組DNA克隆群體；cDNA文庫是指含有所有重組cDNA的克隆群體。???基因組文庫：來源于基因組DNA，反映基因組的全部信息，用于基因組物理圖譜的構建，基因組序列分析，基因在染色體上
cDNA文庫構建
cDNA文庫[原理]：cDNA文庫不同于基因組文庫，被克隆DNA是從mRNA反轉錄來源的DNA。CDNA組成特點是其中不含有內含子和其他調控序列。從而做cDNA克隆時應是先從獲得mRNA開始，在此基礎上，通過反轉錄酶作用產生一條與mRNA相互補的DNA鏈，然后除掉mRNA，以第一條DNA鏈為模板復制
cDNA文庫構建
實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆轉錄引物，或者用隨機引物，給所合成的 cDNA 加上適當的連接接頭，連接到適當的載體中獲得文庫。其基
CDNA文庫篩選
CDNA文庫篩選（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L
cDNA文庫構建
cDNA文庫構建 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。
cDNA文庫構建
cDNA文庫構建可以：（1）用于分離全長基因進而開展基因功能研究；（2）篩選目的基因并直接用于表達；（3）提供構建分子標記連鎖圖譜的所用探針。實驗方法原理cDNA 文庫是指某生物某發育時期所轉錄的全部 mRNA 經反轉錄形成的 cDNA 片段與某種載體連接而形成的克隆的集合。經典 cDNA 文庫構建
CDNA文庫篩選
（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板宿主細菌制備1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。2．將過夜培養物以3000×g離心5min。3．分別用2ml?λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,
cDNA－文庫的構建
此經典方案建立在 Gubler-Hoffman 法（Gulber-Hoffman 1983) 之上，分為六個階段。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）上冊，作者：黃培堂。實驗材料λ噬菌體臂大腸桿菌菌株用于λ噬菌體的包裝抽提物試劑、試劑盒放線菌素 D二硫蘇糖醇EDTATris-ClMgCl2反轉錄酶
cDNA－文庫的構建
? ? ? ? ? ? 實驗材料 λ噬菌體臂 大腸桿菌菌株 用于λ噬菌體的包裝抽提物 試劑、試劑盒 放線菌素 D
消減－cDNA－或基因組－DNA－文庫的制備實驗
一次雙向消減，需要總量為 2ug 的基因組 DNA 或 cDNA。大多數分離 RNA 和基因組DNA 的方法都適用于本實驗（Sambrooketal.1989;ChomczynskiandSacchi1987;Farrell1993)。本實驗來源于 PCR 實驗指南（第二版），作者：種康，瞿禮嘉。試
消減－cDNA－或基因組－DNA－文庫的制備實驗
試劑、試劑盒 緩沖液、溶液和試劑酶和酶緩沖液核酸和寡核苷酸放射性化合物酚儀器、耗材 熱循環儀水浴箱瓊脂糖凝膠電泳所需的試劑與設備實驗步驟 第1階段：RNA和DNA的分離一次雙向消減，需要總量為2ug的基因組DNA或cDNA。大多數分離RNA和基因組DNA的方法都適用于本實驗（Sambrooketal