酵母遺傳學方法12：酵母菌落PCR方法
酵母菌落PCR方法1．在冰上配制反應混合液：2μl 10×菌落PCR緩沖液1.2μl 25mmol/L MgCl20.4μl 10mmol/L dNTPs10pmol &nbs......閱讀全文
酵母遺傳學方法12：酵母菌落PCR方法
酵母菌落PCR方法1．在冰上配制反應混合液：2μl??????????????????10×菌落PCR緩沖液1.2μl?????????????????25mmol/L MgCl20.4μl?????????????????10mmol/L dNTPs10pmol????????????????引物
酵母菌落PCR方法
問：很郁悶，zui近在做電轉畢赤酵母，但是轉化完了沒有合適的篩選方法，如果提基因組的話費時費錢，而且由于我這個電轉的幾率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR方法篩選，但酵母菌破壁很困難，如果處理不好的話基因組釋放不出來，就沒有陽性結果了。查了一些資料說用反復凍融法，是不是直接挑單菌落就行了
酵母遺傳學方法8：酵母活體染色
酵母活體染色1）核DNA和線粒體DNA1．當細胞培養到約107細胞/ml時，離心（5秒）收集細胞，再懸浮在70％乙醇中。2．固定5分鐘或5分鐘以上，用水洗2次。3．將細胞懸浮在含有50ng/ml的4，6-二脒基-2苯基吲哚的封固劑中。1mg/ml的4，6-二脒基-2苯基吲哚母液可在－20℃下貯存。4
酵母遺傳學方法9：酵母免疫熒光
酵母免疫熒光1）細胞制備1．培養5ml酵母至對數生長早期（106～107細胞/ml）。2．直接加1/10體積的甲醛到培養基里固定細胞（加入的甲醛終濃度為3.7％，標準母液是37％）。3．細胞在甲醛中培養至少1小時。4．離心收集細胞，用0.1mol/L磷酸鉀（pH7.5）洗一次。5．把細胞懸浮在1ml
利用PCR分析酵母菌落
利用PCR分析酵母菌落 ? ? ? ? ? ? 實驗方法原理 用 PCR 分析酵母菌落時，無需純化 DNA。本方案以單個酵母菌落的粗裂解液作為 PCR 擴增的模板，來確定酵母中是否攜
利用PCR分析酵母菌落
利用PCR分析酵母菌落主要用于確定酵母中是否攜帶目的DNA序列。實驗方法原理用 PCR 分析酵母菌落時，無需純化 DNA。本方案以單個酵母菌落的粗裂解液作為 PCR 擴增的模板，來確定酵母中是否攜帶目的 DNA 序列。?實驗材料Taq DNA 聚合酶寡核苷酸引物DNA 標準參照物YAC 重組子的酵母
利用PCR分析酵母菌落
實驗方法原理 用 PCR 分析酵母菌落時，無需純化 DNA。本方案以單個酵母菌落的粗裂解液作為 PCR 擴增的模板，來確定 YAC 中是否攜帶目的 DNA 序列。實驗材料 Taq DNA 聚合酶寡核苷酸引物DNA 標準參照物YAC 重組子的酵母菌株試劑、試劑盒 PCR 緩沖液dNTP 溶液儀器、耗材
酵母遺傳學方法11：PCR介導基因破壞法
PCR介導基因破壞法1．反應混合物：5μl?????????????10×Taq緩沖液5μl?????????????25mmol/L MgCl22μl?????????????10mmol/L dNTPs10~100ng?????????模板DNA25pmols??????????引物（每種引物）
技術和方案15－酵母菌落PCR
實驗步驟
酵母遺傳學方法1：DNA分離
酵母DNA分離1）酵母DNA微量制備（40ml）1．在125ml三角瓶中用40ml YPD培養液在30℃條件下培養細胞達最大生長量（過夜）。2．將上述培養物移入螺蓋離心管，用醫用離心機或Sorvall SS－34轉頭以5000r/min離心5分鐘，棄去上清液。3．將細胞懸浮在3ml的0.9mol/L
酵母遺傳學方法5：酵母β－半乳糖苷酶的測定
酵母β－半乳糖苷酶的測定1）??粗提取物測定1．在適當溫度下（通常30℃），用適當培養液將5ml細胞培養物培養到濃度為1×107～2×107細胞/ml。如果自主復制質粒的雜合基因表達，可使用一種適當培養基對存在質粒的菌株進行篩選。2．在冰上冷卻細胞，離心收集。注意：以下步驟保持細胞在冰上。3．棄上清
酵母遺傳學方法3：RNA的分離
酵母RNA的分離1）總酵母RNA的分離1．在每毫升培養物中加入50μg環乙酰亞胺，在30℃下振蕩15分鐘。此步亦可省略，但是有人認為環乙酰亞胺可防止mRNA凝集在多核糖體上。2．迅速冷凍收集細胞，在大離心管中加入約一半體積的碎冰，將培養物倒入，振蕩，在4℃下以5000r/min離心5分鐘。3．加入1
酵母遺傳學方法7：隨機孢子分析
隨機孢子分析1）孢子形成1．挑已形成孢子的二倍體單菌落接種在YPD平板上，盡可能把細胞涂薄一些，在30℃下培養12～16小時，超過16小時將明顯降低孢子的形成率。2．上午，用一個無菌殼板釘取相當一火柴頭量的細胞，轉到含有2.5ml產孢培養基試管中，在25℃下旋轉振蕩培養。3．用光學顯微鏡檢測孢子形成
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案
技術和方案6 酵母 RNA 的分離試劑、試劑盒環乙酰亞胺苯酚LETS緩沖液LiCl乙醇SDS乙酸鈉AE 緩沖液儀器、耗材大離心瓶玻璃珠離心管oligo (dT) 柱實驗步驟大量 RNA 分離程序酵母總 RNA 的分離1.在每毫升培養物中加入 50ug 環乙酰亞胺，在 30°C 下搖晃 15 min。
酵母遺傳學技術
Genome-wide Gene Expression Analysis?(Richard Young Research Group,Whitehead Institute for Biomedical Research)A genoe-wide gene expression analysis u
酵母遺傳學方法4：質粒DNA的羥基突變
質粒DNA的羥基突變1．臨用之前制備羥胺溶液，置冰上待用。2．將用氯化銫純化的10μg質粒DNA加到含500μl羥胺溶液的微型離心管。3．在37℃下培養20小時。4．加入10μl的5mol/L NaCl、50μg 1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）和1ml無水乙醇終止反應，置－70℃沉淀DNA10分
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案3
技術和方案3 酵母 DNA 分離實驗材料質粒DNA玻璃珠試劑、試劑盒YPD消解酶 100TTris-HClSDS乙酸鉀TE 緩沖液RNaseA 溶液山梨醇無水異丙醇裂解緩沖液儀器、耗材三角瓶離心管實驗步驟一、酵母 DNA 微量制備（40 ml)1.在 125 ml 三角瓶中用 40 mlYPD 培養
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案1
技術和方案1 酵母的高效轉化實驗步驟展開
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案7
技術和方案7 質粒 DNA 的羥胺突變試劑、試劑盒羥胺溶液氯化銫純化的質粒DNANaCl牛血清白蛋白無水乙醇TE 緩沖液實驗步驟1.臨用之前制備羥胺溶液，置冰上待用。2.將用 CsCl 純化的 10 埤質粒 DNA 加到含 500ul 羥胺溶液的微量離心管中。3.在 37°C 下溫育 20 h。4.
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案2
技術和方案2 快速粗放的酵母菌落質粒轉化法實驗步驟展
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案4
技術和方案4 酵母蛋白質的抽提試劑、試劑盒NaOHPAGE 樣品緩沖液Tris-HCl甘油β-巰基乙醇溴酚藍實驗步驟1.從液體培養物中或用細菌接種環在平板表面刮菌，收集大約 2.5 OD的細胞量（大約 2.3 mg 濕重）。將細胞重懸于 100ul 蒸餾水中，加入 100ul O.2mol/L Na
酵母遺傳學方法實驗指南——技術和方案5
技術和方案5 TAP純化方法試劑、試劑盒NP-40緩沖液TEV C 緩沖溶液鈣調蛋白結合緩沖液（CBB)鈣調蛋白洗脫緩沖液（CEB)實驗步驟1.培養 3~6L 細胞至濃度為 2X107~3X107 個/ml(OD50=1.0~1.3)。2.離心收集細胞，并用冰預冷的水洗一次。3.用冰預冷的 NP-4
Pichia酵母表達直接PCR鑒定重組子的方法
模板的處理：1.平板上的菌落長到肉眼可見時（約12小時）；2.將除了模板之外的其它PCR反應液的組分準備好，并分裝。引物最好使用Kit中已有的檢測專用的引物，或者一條使用載體上的引物，一條使用基因的特異性引物（這樣做可以鑒定非定向克隆的方向）；3.用半根滅菌的牙簽（節約，而且好用）挑取菌落，在PCR
酵母遺傳學方法2：蛋白質的抽提
酵母蛋白質的抽提此法抽提的酵母蛋白適用于SDS凝膠電泳和Western印跡分析。1．從OD600＝2的細胞培養物中抽提酵母蛋白質。培養物的一種簡單制備方法是將細胞接種到5ml YPD中，過夜培養后獲得指數培養物（OD600＝0.5～2.0）。2．在水浴上把OD600＝2的細胞培養物轉到含有2ml的5
酵母遺傳學方法6：羧肽酶Y的平板鑒定
羧肽酶Y的平板鑒定1．在YPD平板上培養菌落和菌苔（通常菌落長3天，菌苔長1天即可）。2．小心把涂蓋液加在平板的表面使之完全覆蓋細胞。3．待瓊脂凝固5～10分鐘后，小心用新鮮Fast Garnet GBC溶液沖刷表面。4．顯色5分鐘，野生型菌株將變紅，而羧肽酶Y－菌株將呈現黃色或粉紅色。5．倒出Fa
菌落PCR（Colony－PCR）方法
菌落PCR（Colony PCR）可不必提取基因組DNA，不必酶切鑒定，而是直接以菌體熱解后暴露的DNA為模板進行PCR擴增，省時少力。建議使用載體上的通用引物。通常利用此方法進行重組體的篩選或者DNA測序分析。最后的PCR產物大小是載體通用引物之間的插入片斷大小。具體方法：1、PCR混合物的制備T
酵母GST蛋白純化方法
GST Fusion Protein Purification from Yeast5 ml overnight culture of your favorite yeast in your favorite medium.Inoculate 50 ml and grow 30o C shaking
酵母蛋白的提取方法
1 準備SD/-Leu或是YPD 培養基20ml，酵母過夜培養，30℃，230rpm。2 測OD600 約1.0。3 100ml過夜培養物，1000g，離心，5min，4℃。4 棄上清，重懸于80ul抽提buffer：0.1M Tris-Cl（PH7.5），0.2M NaCl，0.01Mβ-ME，2
酵母菌落直接質粒轉化法
酵母菌落直接質粒轉化法1．用牙簽從平板中挑取單菌落（直徑2～3mm），轉移到1.5ml的無菌離心管中。2．將10μl載體DNA（100μg）與10μl轉化質粒DNA混合，振蕩均勻。（若轉化DNA是用未經RNA酶處理的“mini－prep DNA”方法制得，則不需加載體DNA）。3．加0.5ml PL
畢赤酵母LiCl－轉化方法
實驗概要本文介紹了畢赤酵母LiCl 轉化方法。該程序是電轉化的替代方法。轉化效率為102-103cfu/ug線性化DNA。主要試劑溶液準備：不能用醋酸鋰，一定要用氯化鋰1. 用無菌去離子蒸餾水配制1M LiCl，過濾除菌，用無菌水稀釋2. 用無菌去離子蒸餾水配制50%PEG(3350)，過濾除菌，存