雜交瘤技術基本程序與方法3
⑥7.5% NaHCO3溶液 稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。 ⑦HEPES溶液（1mol/L） 稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesulfonic acid，N-2-羥乙基哌嗪- N，-2-乙基磺酸，MW 238.3）溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），4℃保存。 ⑧8-氮鳥嘌呤貯存液（100×） 稱取200mg 8-氮鳥嘌呤（8-azaguanine，MW 152.1），加入4mol/L NaOH 1ml，待其溶解后，加入超純水或四蒸水99ml，過濾除菌；分裝小瓶，-20℃凍存。使用時按1%濃度加入到培養液中（即終濃度為20ug/ml）。 ⑨50% PEG&nbs......閱讀全文
雜交瘤技術基本程序與方法3
⑥7.5% NaHCO3溶液?稱取分析純NaHCO3 7.5g，溶于100ml超純水或四蒸水中，過濾除菌，分裝小瓶（4-5ml/瓶），蓋緊瓶塞，4℃保存。?⑦HEPES溶液（1mol/L）?稱取23.83g HEPES（N-2-Hydroxyethylpiperazine-N，-2-ethanesu
雜交瘤技術基本程序與方法6
③全菌抗原的ELISAS?a、新鮮培養的細菌用蒸餾水或PBS懸浮，并調整細菌濃度至1×108個/ml。必須指出，對于人畜共患病病原體需注意安全操作，最好是滅活處理。?b、每孔中加100ul 5%戊二醛溶液（0.1mol/L NaHCO3 95ml+25%戊二醛溶液5ml），37℃作用2小時，蒸餾水洗
雜交瘤技術基本程序與方法9
?（1） 有限稀釋法?材料：?a、96孔細胞培養板等；?b、HT培養基；?c、活力強的雜交瘤細胞；?d、小鼠腹腔細胞。?方法：?a、制備小鼠腹腔細胞。同“細胞融合”一節中的方法。?b、制備待克隆的雜交瘤細胞懸液，用含20%血清的HT培養基稀釋至每毫升含2.5、15和50個細胞3中不同的稀釋度。?c、
雜交瘤技術基本程序與方法11
（A）免疫擴散法?這種方法簡便、準確，最常用。被檢的McAb樣品通常為雜交瘤細胞培養上清液，由于其中單抗的濃度較低，應先將其濃縮10-20倍左右再檢測。小鼠腹水中的單抗濃度雖很高，但也含有小鼠本身的各類Ig，它們也會與相應抗血清發生反應，使鑒定結果出現混亂，即使將腹水稀釋10-20倍后再檢測也不能完
雜交瘤技術基本程序與方法1
一、雜交瘤技術的誕生?淋巴細胞雜交瘤技術的誕生是幾十年來免疫學在理論和技術兩方面發展的必然結果，抗體生成的克隆選擇學說、抗體基因的研究、抗體結構與生物合成以及其多樣性產生機制的揭示等，為雜交瘤技術提供了必要理論基礎，同時，骨髓瘤細胞的體外培養、細胞融合與雜交細胞的篩選等提供了技術貯備。1975年8月
雜交瘤技術基本程序與方法10
（2）雜交瘤細胞的復蘇?雜交瘤細胞、骨髓瘤細胞或其他細胞在液氮中保存，若無意外情況時，可保存數年至數十年。復蘇時融解細胞速度要快，使之迅速通過最易受損的 -5℃?0℃，以防細胞內形成冰晶引起細胞死亡。?通常情況下，凍存時細胞數量多，生長狀態好的雜交瘤細胞系以及其他細胞的復蘇可采用以下方法，這也是各個
雜交瘤技術基本程序與方法7
?⑦Dot-ELISA試驗?免疫斑點試驗（Dot-ELISA）是以硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜為固相載體，進行抗原抗體反應的免疫檢測手段。該法采用不溶性底物（如DAB，或4-氯萘酚或AgNO3等），其與相應標記物（HRP、AP、膠體金）作用形成不溶性產物，呈現斑點狀著色，從而易于判定結果。根據所用的標
雜交瘤技術基本程序與方法5
下面簡要介紹幾種常用的抗體檢測方法?（1）免疫酶技術?免疫酶技術是將抗原抗體反應的特異性和酶對底物顯色反應的高效催化作用有機結合而成的免疫學技術。由于它特異性強，靈敏度高，現已廣泛用于篩選和鑒定單抗。?①器材和試劑?a、包被緩沖液：?碳酸鹽緩沖液：取0.2mol/L Na2CO3 8ml，0.2mo
雜交瘤技術基本程序與方法2
2、細胞融合?（1）主要試劑的配制?①細胞培養基雜交瘤技術中使用的細胞培養基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco Modified Eagles Medium）兩種基礎培養基，具體配制方法按廠家規定的程序，配好后過濾除菌（0.22um），分裝，4℃保存。??不完全RPMI-1640培
雜交瘤技術基本程序與方法8
（3）間接血凝試驗?間接血凝試驗又稱被動血凝試驗（PHA），是目前應用較廣的檢測方法之一。本試驗是以包被可溶性抗原的紅細胞作為指示系統，當被檢抗體與包被在紅細胞上的抗原產生特異性反應時，導致紅細胞呈凝集現象。可見，該法具有靈敏、快速、容易操作和無需昂貴儀器等優點，而且經改用醛化紅細胞以后，克服原來重
雜交瘤技術基本程序與方法4
4）飼養細胞（Feeder cells）的制備?在細胞融合后選擇性培養過程中，由于大量骨髓瘤細胞和脾細胞相繼死亡，此時單個或少數分散的雜交瘤細胞多半不易存活，通常必須加入其他活細胞使之繁殖，這種被加入的活細胞稱為飼養細胞。飼養細胞促進其他細胞增殖的機制尚不明了，一般認為它們可能釋放非種屬特異性的生長
關于雜交瘤技術的基本介紹
雜交瘤技術（hybridoma technique） 即淋巴細胞雜交瘤技術，又稱單克隆抗體技術。它是在體細胞融合技術基礎上發展起來的。克勒（Kohler）和米爾斯坦（Milstein）（1975）證明，骨髓瘤細胞與免疫的動物脾細胞融合，形成能分泌針對該抗原的均質的高特異性的抗體——單克隆抗體，
PCR技術操作程序與優化方法
作者：李愛麗等 來源：生物技術通報典型的PCR操作在此處僅列出—般PCR操作過程，具體影響因素的優化將在本章第二節討論，每一個具體操作前都需進行必要的優化。（一） 試劑（1）引物根據待擴增DNA不同，引物亦不同，引物的設計見本章第三節。（2）耐熱DNA聚合酶：此酶是從耐熱細菌中分離出來的，能耐受高溫
雜交瘤技術的基本原理
雜交瘤技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞（B淋巴細胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續培養，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。在選擇培養基的作用下，
雜交瘤技術的基本原理
雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠B細胞和小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長（選擇原理見后），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有B細胞與骨
雜交瘤技術的基本原理
雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠B細胞和小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長（選擇原理見后），小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有B細胞與骨
概述雜交瘤技術的基本原理
雜交瘤技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞（B淋巴細胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續培養，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即具有所謂永生性。在選擇培養基的作用
PCR技術的原理與方法（3）
PCR常見問題?一.沒有擴增產物?1.循環溫度：變性溫度、退火溫度?2.引物設計?3.DNA聚合酶活性?4.抑制性成份(蛋白酶、核酸酶、其它抑制聚合 酶活性的成份)?5、DNA樣品?二.非特異產物及電泳呈涂布狀?1.Mg2?濃度?2.調整引物、模板、聚合酶的用量?3.適當減少循環數?4.適當提高退火
關于雜交瘤技術細胞的選擇與融合
建立雜交瘤技術的目的是制備對抗原特異的單克隆抗體，所以融合細胞一方必須選擇經過抗原免疫的B細胞，通常來源于免疫動物的脾細胞。脾是B細胞聚集的重要場所，無論以何種免疫方式刺激，脾內皆會出現明顯的抗體應答反應。融合細胞的另一方則是為了保持細胞融合后細胞的不斷增殖，只有腫瘤細胞才具備這種特性。·選擇同
細胞雜交瘤技術
細胞雜交瘤技術?雜交瘤技術?雜交瘤技術是1975年Kohler和Milstein用于制備單克隆抗體而創建的一項重要技術，被譽為“免疫學上的一次革命”。此技術被廣泛用于各種單克隆抗體的制備。抗體是由B淋巴細胞分泌的，一個B淋巴細胞只能分泌一種抗體。把B淋巴細胞和骨髓細胞融合，即可形成在體外長期存活并分
雜交瘤技術原理
單克隆是指利用在細胞融合基礎上的B細胞雜交瘤技術。??????? 雜交瘤技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞。被特異性抗原免疫的小鼠脾細胞（B淋巴細胞）的主要特征是它的抗體分泌功能，但不能在體外連續培養，小鼠骨髓瘤細胞則可在
雜交瘤技術制備催化抗體的方法介紹
經體內免疫后再進行細胞融合是制備抗體酶的一種傳統方法。雜交瘤技術的基本原理是用不能在培養液中生長的但能產生抗體的脾臟細胞，與能在培養液中生長的骨髓瘤細胞進行融合，融合得到的雜交細胞既能產生抗體又能在體外培養，通過選擇培養，以獲取能產生單克隆抗體的雜交瘤細胞。再把這些細胞單克隆化，即繁殖成母體的同
淋巴細胞雜交瘤單克隆抗體制備技術3
抗體的制備方法與原理一、抗血清的制備 有了質量好的抗原，還必須選擇適當的免疫途徑，才能產生質量好（特異性強和效價高）的抗體。 （一）用于免疫的動物 作免疫用的動物有哺乳類和禽類，主要為羊、馬、家兔、猴、豬、豚鼠、雞等，實驗室常用者為家兔、山羊和豚鼠等。動物種類的選擇主要根據抗原的生物學特性和所
細胞破碎技術的基本概念及其基本方法3
（6）凍結-融化法將細胞放在低溫（-150C），然后在室溫中融化，反復多次，細胞壁破裂。（7）干燥法經干燥后的菌體，其細胞膜的滲透性發生變化，同時部分菌體會產生自溶，然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時，胞內物質就會被抽提出來。破碎率定義為被破碎細胞的數量占原始細胞數量的百分比數，即： Y(%)=[
雜交瘤細胞技術分析
雜交瘤細胞技術分析克隆化的細胞可以在體外進行大量培養，收集上清液而獲得大量的單一的克隆化抗體。不過體外培養法得到的單克隆抗體有限，其不能超過特定的細胞濃度，且每天要換培養液。而體內雜交瘤細胞繁殖可以克服這些限制。雜交瘤細胞具有從親代淋巴細胞得來的腫瘤細胞的遺傳特性。如接種到組織相容性的同系小鼠或不能
雜交瘤細胞的基本介紹
雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特征。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠細胞與小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特征是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有b細胞與骨髓瘤細胞融合的
動物實驗基本技術3
第七節 實驗動物的處死當實驗中途停止或結束時，實驗者應站在實驗動物的立場上以人道的原則去處置動物，原則上不給實驗動物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安樂死。安樂死是指實驗動物在沒有痛苦感覺的情況下死去。實驗動物安樂死方法的選擇取決于動物的種類與研究的課題。一、蛙 類常用金屬探針插入枕骨大孔,破壞腦脊髓的
動物實驗基本技術3
第七節 實驗動物的處死當實驗中途停止或結束時，實驗者應站在實驗動物的立場上以人道的原則去處置動物，原則上不給實驗動物任何恐怖和痛苦，也就是要施行安樂死。安樂死是指實驗動物在沒有痛苦感覺的情況下死去。實驗動物安樂死方法的選擇取決于動物的種類與研究的課題。一、蛙 類常用金屬探針插入枕骨大孔,破壞腦脊髓的
簡述雜交瘤技術有限稀釋與抗原特異性選擇
在動物免疫中，應選用高純度抗原。一種抗原往往有多個決定簇，一個動物體在受到抗原刺激后產生的體液免疫應答實質是眾多B細胞群的抗體分泌，而針對目標抗原表位的B細胞只占極少部分。由于細胞融合是一個隨機的過程，在已經融合的細胞中有相當比例的無關細胞的融合體，需經篩選去除。篩選過程一般分為兩步進行：一是融
定量PCR技術基本原理和方法以及PCR產物的檢測與定量3
1) 特異性捕獲檢測法（非探針雜交捕獲）本法是非特異性檢測PCR產物的一種方法，用生物素標記引物和地高辛標記duTP或用生物素和地高辛分別標記其引物。經PCR擴增后，PCR產物中同時摻入了生物素和地高辛。用生物素包被孔捕獲PCR產物，用酶（AKP）標抗地高辛和產物反應，加底物顯色進行定量，此法是非序